Réf ABG-126286

Stage master 2 / Ingénieur

Durée 6 mois

Salaire net mensuel 610 €

15/10/2024

Amiens Les Hauts de France France

• Biochimie
• Biologie

paroi végétale, pectines, pectine acétylestérase, structure/fonction, analyse in silico/ cell wall, pectin acetyl esterase, heterologous expression, Pichia pastoris, enzyme activity, in silico analysis

29/11/2024

Beta vulgaris spp. vulgaris (betterave sucrière) est une culture majeure dans le nord de la France, principalement exploitée pour la production de sucre. Les coproduits industriels issus de la transformation de la betterave sucrière, bien que riches en pectine, ont des applications commerciales limitées. La pectine, constituant clé de la paroi cellulaire primaire chez les plantes dicotylédones telles que la betterave sucrière, est un polysaccharide complexe qui pourrait être davantage valorisé dans diverses utilisations. Toutefois, son utilisation actuelle reste restreinte, ce qui souligne la nécessité de recherches visant à améliorer ses propriétés fonctionnelles pour des applications industrielles plus larges. Les pectines sont des polysaccharides complexes, riches en résidus d’acide galacturonique, et structurés principalement sous forme d’homogalacturonanes (HG) et de rhamnogalacturonanes I et II (RGI, RGII). Les HG et RGI peuvent-être acétylés sous l’action d’acétyltransférases en position O2 et/ou O3, au sein de l’appareil de Golgi, et le degré d’acétylation de ces polysaccharides peut être modulé par l’action des pectine acétylestérases (PAE, EC 3.1.1.6) au sein de la paroi. Les pectines, qui représentent 20% de la biomasse sèche de la pulpe de la betterave sucrière, co-produit de la betterave, possèdent peu de propriétés gélifiantes, qui est lié à leur fort degré d’acétylation (>20%) contrairement aux pectines de citron (<1%). L’action de PAE sur ces pectines pourrait contribuer à l’amélioration de leur propriété gélifiante et donc leur valorisation. Mais cela nécessite au préalable une connaissance très fine du mode d’action et de la structure de ces enzymes qui sont très peu étudiées. Chez Arabidopsis thaliana, 12 gènes codant les PAE ont été identifiés (Philippe et al., 2017) alors que chez la betterave sucrière, il existerait 10 séquences putatives codant les PAE.

L’objectif du stage vise à (i) réaliser une analyse in silico des PAE chez la betterave sucrière, (ii) d’exprimer une PAE de betterave sucrière en système hétérologue (Pichia pastoris) et de la purifier par chromatographie d’affinité et (iii) déterminer la spécificité du substrat sur lequel la PAE agit, et ainsi caractériser une potentielle homogalacturonane acétylestérase (HGAE) ou rhamnogalacturonane acétylestérase (RGAE).

Reference: Philippe et al (2017) doi.org/10.1186/s12864-017-3833-0

Beta vulgaris spp. vulgaris (sugar beet) is a major agricultural crop in northern France, primarily cultivated for sugar production. Industrial by-products from sugar beet processing, although rich in pectin, have limited commercial applications. Pectin, a key component of the primary cell wall in dicotyledonous plants such as sugar beet, is a complex polysaccharide that could be further exploited for various uses. However, its current utilization remains restricted, highlighting the need for research into improving its functional properties for broader industrial applications. The pectic polysaccharides are primarily composed of homogalacturonan (HG) and branched rhamnogalacturonan I and II (RGI and RGII). Pectic polysaccharides have a galacturonic acid (Gal A) rich backbone which can be acetylated in both HG and RGI. Pectin is synthesized from nucleotide sugars in the Golgi and then secreted as acetylesterified form into the cell wall. The structure of pectin can be deacetylated by pectin acetylesterases (PAEs, EC 3.1.1.6) which catalyze the removal of acetyl groups.

In sugar beet, ten putative PAE genes have been annotated, while 12 PAE genes have been identified in Arabidopsis thaliana (Philippe et al., 2017). Pectin from sugar beet contains high level of acetylated residues (>20%) compared as citrus pectin (around 1-2%) which limits the use of sugar beet pectin in the traditional applications such as gelling for pharmaceuticals or food products. It is hypothesized that PAEs could enhance the gelling properties of sugar beet pectin by removing acetyl groups. However, before this application can be realized, the activity and substrate specificity of these enzymes must be characterized.

The aims of this project are: (i) to perform an in silico analysis of the sugar beet PAE gene family; (ii) to overexpress one sugar beet PAE in a heterologous expression system (e.g., Pichia pastoris) and purify it using affinity chromatography; and (iii) to determine the substrate specificity of the enzyme, specifically whether it targets HG or RGI, to potentially identify a homogalacturonan acetylesterase (HGAE) or rhamnogalacturonan acetylesterase (RGAE).

Reference: Philippe et al (2017) doi.org/10.1186/s12864-017-3833-0

Domaines de compétences : Biochimie des protéines-Expression hétérologue (Pichia pastoris) - Activité enzymatique- Des notions en biologie végétale seront appréciées.

Profile and knowledges required: The ideal candidate will possess a solid background in biochemistry, with a focus on heterologous expression systems, protein purification, and enzymology. Additionally, knowledge in plant biochemistry and plant physiology would be highly valued. Additional training will be provided.